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医疗诊断微球应用指南

医疗诊断微球应用指南

聚合物微球可用于侧向流层析、乳胶凝集、流式芯片测试和浊度测定等多种诊断领域的检测。微球的性能受到多种参数的影响,例如表面属性、粒径、单分散性,这些参数最终都能够影响诊断试剂的性能。因此,了解如何选择微球非常重要。

蛋白与微球的结合,很大程度上取决于微球的表面官能团及其浓度。微球的大小,则与检测灵敏度、线性密切相关。一般而言,粒径越小,对线性范围越有利;而粒径越大,则对灵敏度越有帮助。而微球的单分散性,则与批间差有关联。

因此,选择合适的微球,对开发稳定、可重复的优质诊断试剂至关重要。

表面属性对疏水吸附的影响

     微球表面,即使带有磺酸基和羧基等亲水基团的微球表面,均可与生物分子,包括蛋白、短肽、和其它小分子,发生疏水(被动)吸附。

    

     上述的物理吸附随着蛋白分子量的增大而升高。聚苯乙烯微球表面大多数是C—C键、C—H键等疏水分子链形成的区域构成的。这些区域可与生物分子的疏水区域形成物理吸附作用。蛋白与微球通过多点吸附的方式与这些区域相互作用,在混合蛋白溶液中,大分子蛋白会优先吸附到微球表面。

     因此,在蛋白质混合液的包被中,分子量大的蛋白,会优先被吸附到微球表面。在最佳的pH下,将微球和蛋白混合在一起,微球很容易对类似于抗体这类物质的进行特异性吸附,然后通过离心等方法,可将未交联的蛋白除去。

表面功能化的微球可以和蛋白质(或其它生物分子)发生共价偶联,从而实现微球与蛋白质(或其它生物分子)的共价结合。

羧基修饰微球经过EDC/NHS活化之后,很容易与蛋白质发生反应。值得注意的是,这些微球在高浓度的电解质(高达1 M的一价盐)中更加的稳定。

醛基修饰微球是将醛基修饰到微球表面。醛基可以和蛋白质的氨基通过形成希夫碱而发生反应。醛基修饰微球不需要活化,仅需一步,就能实现和蛋白质的共价偶联。

氨基修饰微球则是由羧基微球通过将羧基转变成氨基而制备得到。这类微球在某些情况下,更容易与抗体的羧基发生共价偶联。

如何计算单个官能团平均占位面计(Parking Area ,PA

微球的单个官能团平均占位面计(Parking Area, PA)是指每个官能基团,例如羧基,在微球表面的平均占位面计。一般用Å2表示,是一项衡量基团在微球表面密度的指标,计算公式为:

其中:P为官能团平均占位面积(Parking AreaPA),单位:Å2Dc为表面官能团密度,一般由滴定获得,单位:μeq/g微球;ρs球密度,单位:g/cm3d为平均直径,单位:μm

上述公式显示,PA值越小,则官能团平均占位面积越小,表明官能团密度密度越高。此指标考虑了粒径与官能团密度的相互关系,能跟准确地反映官能团密度,比单纯的官能团密度更真实地反映官能团的状况。

蛋白的包被

微球表面包被蛋白质有两种结合方式:被动吸附和共价交联。

I)被动吸附

被动吸附的方式非常迅速,在微球表面增加蛋白质的量,能在短时间内形成蛋白包被层,使微球表面的蛋白达到饱和状态。我们可以根据以下经验公式,大致计算微球粒径与最大蛋白包被量之间的关系。其关系如下:

S=5.71/D

其中S1g微球的表面积,单位:m2D为微球直径,单位:μm

由此可见,一定量的微球,粒径越小,则面积越大,理论上所能包被的蛋白数量也就越高。

值得注意的是,被动吸附虽然作用力很强,但并不是永久性的。很多试剂都能使微球表面的蛋白质解吸附。

II)共价偶联

蛋白质可通过多种方式共价交联到微球表面。微球表面含有环氧基、氯甲基、醛基、羧基等基团,都可以和抗体的Fc端的氨基反应,形成共价键。当选择共价交联方式的时候,往往需要考虑交联的效期、工艺复杂程度和最后的带电状况。

前三种基团可以直接与蛋白的氨基反应,形成共价键,使用起来较方便,但储存稳定性较之羧基微球稍差。而羧基微球则需经过EDC/NHS活化之后,才与蛋白的氨基反应,形成共价键。由于羧基微球本身不具有直接和蛋白质反应的性能,因此具有较强的化学稳定性。两种方法各有优缺,在选择的时候,需根据本身的情况进行选择。

羧基微球是目前使用较多的微球,目前流行的工艺是使用EDC+NHS)活微球的羧基,然后和抗体的氨基交联。交联后的带电状况也是很重要的问题,它直接影响到实际的稳定性。在共价交联中,羧基(或氨基),不仅仅是提供共价交联的基团而已,它们对交联之后形成的复合物的带电状况、整个体系能否维持稳定的溶胶状态,具有十分重要的作用。微球的稳定性取决于表面携带的电荷、包被蛋白的种类、数量、及缓冲液等因素。一旦处理不当,很容易引起团聚及非特异性吸附。尤其要注意的是IgG具有较低的电荷密度和较高的疏水性,交联到微球上之后,较容易破坏稳定性。

 

 

 

蛋白包被指南

1.共价交联原理

1EDCNHS活化羧基偶联

上述图示中,微球的羧基被EDC活化后,形成的中间产物可直接与抗体的氨基反应,形成共价键。这就是一步法。

也可以被水解,还原成为羧基。所以微球一旦被活化,应马上使用。

还可以进一步和NHS反应,形成的中间产物,可与抗体的氨基反应,形成共价键。这就是两步法。

2)醛基偶联

上述图示中,微球的醛基可与抗体的氨基反应,脱去1分子H2O,然后在NaCNBH3的作用下氧化,形成稳定的CN键。值得注意的是,醛基在一定的pH下会产生水解,其微球的储存稳定性应引起注意。

1.活化缓冲液

50 mMMESpH6.1pH可根据实际情况浮动,但不建议做太大改变。也稀释一定的倍数,但不建议过度稀释。

关于pH值的选择,与包被的蛋白的等电点有关,在等电点附近,有利于最大限度的使蛋白沉淀在微球表面;远离等电点,则有利于蛋白构象的舒展,避免拥挤,影响活性。

置于4℃下保存、备用。

2.包被缓冲液:

考虑EDC(或EDC/NHS)活化后形成中间产物的稳定性,及抗体的稳定性,建议pH57为佳。因此,也可以使用50 mMpH6.1MES

3.粒子与蛋白比例

粒子上抗体的包被量,直接关系到包被结果及成本。如果包被量太低,则有可能不利于最大程度上捕获抗原;如果包被量太高,则有可能不利于节省成本,甚至可能过于“拥挤”而使部分抗体失去活性。一般而言,我们建议每100 mg的微球,包被5~30 mg的蛋白不等。大微球比表面积小,包被蛋白的量较少;小微球比表面积大,包被蛋白的量较多。每个项目抗体不一样、每个厂家的抗体来源有差异,具体的包被量,仍需按照实验结果摸索。

在生化平台上,一般的,每100 mg的微球,我们的建议包被量如下:

在层析平台上,由于每个微球上连接抗体的数量,直接影响到最终检测的灵敏度。在理论上,最佳的结合状态是每个微球偶联一个抗体,可达到最佳的检测灵敏度。因此,我们建议此平台看题的包被量可大幅下调。

 

1.Wash  洗涤缓冲液

磷酸盐缓冲液(PBS),0.1 MpH 7.2

不同的缓冲液在不同项目中表现出不同的结果,客户需要根据本身的实际情况进行优化,找出最佳的缓冲体系及pH值。

2.Storage Buffer  保存缓冲液

磷酸盐缓冲液(PBS),0.1 MpH 7.20.1%的甘氨酸,0.1%NaN3

不同的缓冲液在不同项目、不同的检测平台中表现出不同的结果。以上的缓冲液,建议客户应用于生化平台上。但仍然需要根据项目本身情况进行优化。找出最佳的缓冲体系及pH值。

值得注意的是,层析平台的缓冲体系可能pH要稍高些,需要客户根据自己的具体情况作出调整。

3.Blocker  封闭剂

封闭剂的选择,对结果的线性、灵敏度、稳定性、防止非特异性吸附等方面有重要影响。常见的封闭剂有BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20、甘氨酸等。客户需要根据本身的实际情况进行优化,找出最佳的封闭剂。

4.Carboxyl-modified Beads Coupling Protocol  羧基微球包被步骤

活化:

建议:

1.MES缓冲液的pH值可适当调整,以接近抗体的等电点为佳。

2.在包被步骤,尽量避免使用多价阴离子的缓冲液,比如磷酸或硼酸缓冲液。

3.甘氨酸是用做封闭剂的,可避免非特异性吸附。但也不是万能的,需要筛选最佳的封闭剂。

用于核酸纯化的磁性纳米微球应用指南

常见问题

1.回收率较低

 

原因

对策

去除乙醇不彻底

最后一次洗涤后,请仔细去除洗涤缓冲液。可以在5560℃下放置5 min,使乙醇挥发。

洗脱不充分

如果加温至5560保持2 min,能够更加有效地提高洗脱效率。

洗脱时间不合适

最恰当的吸附时间,对于DNA溶液是1 min.

洗脱时搅拌不充分

洗脱的时候,如果磁珠的混合不充分,回收量会减少。在分离磁珠后,磁珠会在离心管壁结块,请仔细将其散开。

2.回收核酸吸光度不准确

 

原因

对策

清洗不充分

吸附液中含有吸收紫外线的物质。要对回收的核酸定量,请用洗涤液以及70%乙醇溶液来清洗。

混入了吸附液

吸附液中含有吸收紫外线的物质。请仔细去除吸附液。用吸水纸等擦拭试管盖子上占有的吸附液,可以有效改善状况。

3.回收后的核酸不能很好地反应

 

原因

对策

盐阻碍了反应

吸附液中含有高浓度的盐分,请增加两次70%乙醇溶液清洗的工序。

乙醇阻碍了反应

请按照操作程序,充分干燥以去除乙醇。

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